第三章　活性氧与氧化应激

第一节　自由基与氧自由基

一、自由基

自由基（free radical，FR）是指单独存在且具有不配对价电子的离子、原子、分子基团。它们的共同特征是最外层电子轨道上具有不配对电子。氢原子可视为最简单的自由基。具有未成对电子的过渡金属离子一般不列入自由基的范围，但有人将它们看成一类特殊的自由基。

自由基原本是化学概念，20世纪80年代初才开始受到生物医学领域科学工作者的重视。物质由原子组成，原子又由原子核和外周分布的电子组成。电子轨道存在能量差异，由外层向内层能量逐渐降低，而电子则分布在不同能级的电子轨道上。每个轨道上最多只能分布两个自旋方向相反的电子，称为配对电子（paired electrons）。最外层的电子称为价电子。价电子可与其他原子或分子通过电子连接成新的化合物，连接两个电子的形态称为“键”。在化学上用一个黑点来表示电子，如当A与B两个分子或原子形成共价键时，就可用A：B来表示。这两个电子既可以来源于A或B中任一个分子或原子，也可以各从A和B来源一个电子。由共价键A：B结合起来的物质得到外界能量（例如热、光、射线、化学能等）作用时，共价键可能会发生断裂。共价键断裂后，电子被断裂的分子或原子的A或B各分得一个电子的过程和状态称为均裂，而断裂的共价键上两个电子由A或由B独占的过程和状态称为异裂，可以用下列反应式表示这两种情况：

均裂：A：B→A·+ B·

异裂：A：B→A+ + B-

A：B的共价键电子本来是配对电子，当得到能量均裂后，A或B各得到一个电子，不配对，称为不配对电子（unpaired electron）。这些具有不配对的价电子及其母体就叫自由基。反之，如水（H2O）发生异裂时，生成H+和OH-，它们分别称为氢离子和氢氧根离子，由于它们都没有不配对的电子，因此不是自由基。自由基既可以是分子或原子，也可以是带有正或负电荷的离子，也可以是分子团。以前曾把过渡性金属（transition metal）元素也看作自由基，严格地讲，虽然过渡性金属元素的电子层内层也具有不配对电子，但是由于没有最外层电子的不配对特点，因此不是自由基。

二、氧自由基与活性氧

氧自由基（oxygen free radical，OFR）是指单独存在的、具有不配对价电子的氧原子或氧分子基团。生物机体内存在的氧自由基包括超氧阴离子自由基（）、羟自由基（·OH）、氢过氧自由基（HO2·）、烷氧基（RO·）、烷过氧基（ROO·）、脂氧自由基（LO·）、脂过氧自由基（LOO·）、一氧化氮自由基（NO·）与二氧化氮自由基（NO2·）等。

在pH值为7.45条件下，氧还原成水需要接受4个电子：

氧分子的电子排布特性决定了其在生成水的反应中不是同时接受4个电子，而是经过四步作用才能逐渐还原成为水。同时，在其还原过程中还可生成3个中间产物，即超氧阴离子自由基（）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（·OH）。

其中，H2O2为分子形式，性质比较稳定，可以扩散较远的距离，作用时间亦较长，并可在细胞中存在较久，且可穿过细胞膜，因此从这个意义上讲，H2O2是一个“长效”氧化剂，它对生物体具有更为广泛的影响。·OH是一个极强的氧化剂，一旦产生，便可立即氧化与之相邻的任何生物分子，如核酸、蛋白质、糖以及细胞中的多种成分。然而，只有生物体中执行重要功能的分子被·OH氧化（如核酸和蛋白质等）才会造成十分严重的后果，其他一些无关紧要的分子被氧化时，则可能影响作用及后果均不明显。同时，·OH的寿命极短，稳定性极差，而氧化性又极强，故当其产生后常常未及扩散，便已与相邻分子发生了反应。而且，·OH即使发生扩散，也仅能扩散5～10个分子直径的距离。因此，·OH生物学作用的强弱完全取决于其生成部位的局部环境，既可能严重影响生物体的某些重要功能，也可能不造成任何损伤。的半衰期也比较短，产生的生物效应有限。由于H2O2不是自由基，故从生物效应角度分析，不应局限于氧自由基的生物作用，应该引入另外一个重要的概念——活性氧。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类由氧形成、并在分子组成上含氧且化学性质比氧自身活泼的物质总称。在正常的代谢中，可生成各种形态的含氧物质，他们比正常形态的氧更具有活性。ROS包括上述所有的氧自由基，但是，ROS并非都是自由基，因为其中还有一些物质只是含氧活性较强的普通分子，不属自由基，如过氧化氢（H2O2）、氢过氧化物（ROOH）、过氧化脂（LOOH）、过氧亚硝基阴离子（ONOO-）、单线态氧（1O2）、次卤酸（HOX）和臭氧（O3）等。同样，自由基中也有不属于ROS的成分，如C·、Cl·等。ROS中的一氧化氮自由基（NO·）与过氧亚硝基阴离子（ONOO-），因分子中含氮，又称为活性氮（RNS），它们在细胞代谢过程中具有重要意义，因超出本章讨论范围，在此不作详述。

三、ROS生成的主要途径

在人体代谢过程中，在细胞膜、细胞质、线粒体、内质网、细胞核、质膜等部位均可产生ROS，其主要的生成途径如下。

1.在细胞质内存在很多种氧化酶，如黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、醛氧化酶、还原型辅酶Ⅱ氧化酶（NADPH氧化酶）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、二胺氧化酶、一氧化氮合酶（NOS）等。在这些氧化酶催化的氧化还原反应中，均可产生氧自由基。

（1）黄嘌呤氧化酶

（2）蛋白激酶C

（3）还原型辅酶Ⅱ氧化酶

（4）一氧化氮合酶：NOS广泛存在于血管内皮细胞、血小板、小脑、丘脑、大脑皮层、垂体、肠肌神经丛、血管壁神经丛、脊髓传入神经、视网膜、嗅细胞、肾上腺、阴茎海绵体、前列腺等处，它能使L-精氨酸与氧作用生成NO·。

2.组织内的很多种脱氢酶，如二氢乳清酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶、铁氧还蛋白-NADP还原酶等在其催化的反应中，可产生O2·。

3.低分子化合物、脂类、蛋白质等自动氧化，可产生氧自由基。比如氧合血红蛋白和氧合肌红蛋白的Fe2+可将一个电子转给氧分子（O2）生成氧自由基（O2·）和氧合高铁血（肌）红蛋白。

4.人的中性粒细胞溶酶体（lysosome）中富含髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）。当其被激活后，该酶从溶酶体内释放到空泡和细胞的外环境中，催化H2O2与卤化物反应，产生次卤酸，次卤酸与O2作用生成·OH。

5.线粒体电子漏指的是分子氧在线粒体细胞色素氧化酶系统中接受一个电子而被还原生成O2·，其表现通式为：

自由基具有多种生物学活性，其中重要作用之一就是介导含氧物质生成ROS，自由基介导ROS的生成主要通过Fenton和Haber-Weiss反应完成。H2O2既可由O2·自发歧化产生，也可经酶促歧化生成。H2O2本身并非自由基，但它与氧自由基的产生有密切关系。此外，·OH自由基的产生不仅需要或H2O2，而且要有过渡金属（如铁的螯合物）存在。由铁催化的Fenton和Haber-Weiss反应可迅速形成·OH，而单纯的Haber-Weiss反应则速度很慢，很难形成·OH。Haber-Weiss反应原理如下：

此外，当生物体受到某些外界因素（如射线、高压氧、香烟烟雾、空气污染、金属离子、杀虫剂、抗生素、抗癌及麻醉药物或化学试剂等）的作用时，其体内ROS的产生可能增加。如物理因素（射线、光、热等）、化学因素（氧化还原反应、电子传递、金属离子催化、药物等）和生物因素（酶的催化）等均可使生物体产生ROS。许多细胞在氧化应激状态下也会不断产生一定量ROS，如生成浓度约为10nmol/L的H2O2、0.1nmol/L的、1.0～10.0μmol/L的·OH等。据此估计，人类每人每年生成的约2kg以上，而每个细胞每天约消耗1012个氧分子，并产生72×1010个H2O2分子。

四、ROS的生理作用

Oberly在早年的研究中发现，微量ROS对于正常细胞分化是不可缺少的。而且，目前的研究结果也已初步证实，ROS作为细胞重要的信号分子，其剂量变化对于细胞的增殖具有调控作用，即两者存在剂量-效应关系。ROS是一类小分子生理递质，它们可以自由通透细胞质膜，穿越胞外空间，进入邻近细胞，在细胞间传递信息。如NO作为舒张因子时，能以旁分泌的方式自由地从血管内皮扩散进入血管平滑肌；而作为神经递质，则可以通过神经突触传递于神经元之间。ROS在细胞信号传导过程中起着十分重要的调控作用，如它可以通过氧化还原修饰作用改变信号分子的活性及功能，调节细胞的生长、分化等生理过程。此外，ROS在人体内还有其他作用，如白细胞吞噬细菌时需要产生活性氧来消灭细菌，合成前列腺素时尚需要某些活性氧的参与。

1.参与凝血酶原的合成

从凝血酶原前体的羧化作用过程可知，这羧化过程需要一种“活性碳”。这可由超氧离子（或超氧化物，或通过过氧化物）与CO2反应而形成。

2.参与胶原蛋白的合成

在胶原蛋白结构中具有的羟脯氨酸、羟赖氨酸、半乳糖基羟赖氨酸和葡萄糖基半乳糖基羟赖氨酸都是由羟化作用所形成。而酶促羟化作用需要，HO·，H2O或1O2参与。

3.参与白细胞杀菌

白细胞杀菌作用包括一系列杀菌体系。这一体系利用H2O2、，并由髓过氧化物酶催化。白细胞的杀菌活力可被SOD和CAT所抑制，这表明和H2O2两者相互作用形成HO·和1O2这两种制菌剂。

4.参与对癌细胞的杀伤

T淋巴细胞、B淋巴细胞、K细胞、巨噬细胞、粒细胞、天然杀伤细胞对癌细胞的杀伤，也靠氧自由基。

5.参与细胞内解毒功能

有毒物质、氧、NADPH的电子（e）在细胞色素P450作用下，使氧激活产生氧自由基，然后将一个氧原子插入毒物分子内，生成无毒性的氧化毒物。

五、人体对ROS的抗氧化防御系统

实验证明，体内ROS既不能缺少，也不能过多，必须维持在一定水平。人体内存在的自由基清除系统，可清除过多的ROS，使其维持在正常范围。

1.抗氧化酶类

人体中的抗氧化酶主要有SOD（超氧化物歧化酶）、GSHRX（谷胱甘肽过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）等。它们在人体中对于防止氧自由基对人体的损伤具有重要的作用。

2.抗氧化剂

包括维生素E、维生素C、辅酶Q、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素（如硒、铜、锰）等。

3.氧自由基的修复

在通常情况下，人体内产生的氧自由基，绝大部分都被抗氧化防御系统所降解。极少量的氧自由基“逃过”了防御系统的作用，造成生物分子的损伤，使后者成为自由基，然而这些自由基又可在抗氧化系统作用下转变为原来的生物分子，这种现象称为自由基修复，通过酶反应的生物分子修复，通常称为生化修复。